Lớp học nhỏ đã nói với mọi người.Tuyển tập báo cáo các nghiên cứu khoa học quốc tế ngành y học dành cho các bạn tham khảo đề tài: ELISA Methodology Development Practice Edition - Quantitative Methodology Development for Biomolecular Detection。
Trong kỳ này, Tiểu Áo lại chia sẻ với các bạn một chủ đề quan trọng khác: "Phiên bản thực tiễn phát triển phương pháp học ELISA - Phát triển phương pháp đo lường ái lực".

I. Lời nói đầu

Hiện nay được sử dụng để xác định ái lực giữa các phối tử thụ thể, tức là phương pháp phân ly hằng số cân bằng, chủ yếu là:

1. Phương pháp xác định nhiệt động lực học
2. Phương pháp xác định động lực học
3. Phương pháp nồng độ bão hòa

Trong đó phương pháp đo động lực học và phương pháp nồng độ bão hòa tương đối chung:Phương pháp xác định động lực học(Ảnh: Biacore)Liên quan đến việc đầu tư dụng cụ đắt tiền hơn,Phương pháp xác định nồng độ bão hòa là phương pháp thường dùng của tuyệt đại đa số doanh nghiệp dược phẩm sinh học trong nước.

Việc xác định ái lực của ELISA là mô hình chính của nồng độ bão hòa, thường được sử dụng để đánh giá hoạt động của protein kháng nguyên hoặc mức protein kháng thể và đánh giá sự ổn định của kháng thể.
ELISA được sử dụng để xác định ái lực thường không có bộ dụng cụ thương mại và đòi hỏi sự phát triển phương pháp luận của nhân viên thí nghiệm.

Do thiếu giáo dục trong lĩnh vực công nghệ sinh học và sự tích lũy của các doanh nghiệp nghiên cứu và phát triển thuốc mới trong ứng dụng này không đủ, một phương pháp xác định ái lực ELISA có thể được xác minh bằng phương pháp luận là một vấn đề khó khăn đối với nhiều người hành nghề, và rất có thể có những sai lầm như truyền sai số mới hoặc sai lệch.
Một trong những sai lầm là sử dụng các điều kiện thí nghiệm định lượng ELISA để phát triển các phương pháp đo ái lực ELISA.

Bài viết này bắt đầu với các nguyên tắc cơ bản của phương pháp xác định ái lực.Mô tả các nguyên tắc cơ bản của nồng độ bão hòa Affinity, phác thảo mối quan hệ liều lượng của kháng thể kháng nguyên trong quá trình phát triển phương pháp ELISA và một số lỗi có thể xảy ra khi ELISA được sử dụng để áp dụng phương pháp Affinity, và giới thiệu cho bạn các phương pháp chung của Affinity và sơ đồ phát triển phương pháp sơ bộ.

II. Khái niệm cơ bản về Affinity

Chúng tôi phân tích một vài trường hợp phản ứng hóa học và giải thích với các bạn cái gì gọi là sự tương tác.

例子A
Hydrogen và oxy tạo ra nước trong điều kiện bắt lửa.
Khi dừng phản ứng, nếu nồng độ mol của hydro trong môi trường phản ứng xảy ra gấp 2 lần nồng độ mol của oxy, cả hai đều được tiêu thụ và chỉ có nước trong môi trường phản ứng; Nếu nồng độ mol của hydro lớn hơn 2 lần nồng độ mol của oxy, oxy được tiêu thụ và chỉ có hydro và nước trong môi trường phản ứng; Khi nồng độ mol của hydro trái cây nhỏ hơn 2 lần nồng độ mol của oxy, hydro được tiêu thụ và chỉ có oxy và nước trong môi trường phản ứng.
Đây là kiến thức cơ bản về phản ứng hóa học, kết quả của phản ứng hóa học, chất phản ứng có thể trở thành chất sinh ra, tức là phản ứng có thể tiến hành đến cùng, phản ứng có quá trình và đặc tính kết quả của phản ứng như vậy được gọi là phản ứng không thể đảo ngược.

例子B
Kháng nguyên PD1(Cd279)Kháng thể PD1Ví dụ: PEcủa mbrolizumab)Phản ứng ở nhiệt độ bình thường và áp suất bình thường.
Tại thời điểm dừng phản ứng, nếu nồng độ mol của CD279 trong môi trường phản ứng là 200 nM, pembrolizumab là 100 nM, phức hợp pembrolizumab-CD279 trong điều kiện lý tưởng là 97,86 nM, CD279 là 4,28 nM và pembrolizumab là 2,14 nM;
Nếu nồng độ mol của CD279 trong môi trường phản ứng là 100 nM, pembrolizumab là 200 nM, phức hợp pembrolizumab-CD279 là 49,81 nM, CD279 là 0,38 nM và pembrolizumab là 159,19 nM trong điều kiện lý tưởng.

Ví dụ C
Kháng nguyên PD1(Cd279)Kháng nguyên PDL1(Cd274)Phản ứng ở nhiệt độ bình thường và áp suất bình thường.
Nếu nồng độ mol của CD279 trong môi trường phản ứng là 200 nM, CD274 là 100 nM, phức hợp CD274-CD279 là 2,35 nM, CD279 là 197,65 nM và CD274 là 97,65 nM trong điều kiện lý tưởng khi hoàn thành phản ứng;
Nếu nồng độ mol của CD279 trong môi trường phản ứng là 100 nM và CD274 là 200 nM, phức hợp CD274-CD279 là 2,35 nM, CD279 là 97,65 nM và CD274 là 197,65 nM trong điều kiện lý tưởng khi hoàn thành phản ứng, phần lớn CD279 và CD274 không tham gia vào phản ứng.
Trường hợp B và C trong cả hai trường hợp, kháng nguyên và kháng thể(Phối tử và thụ thể)Phản ứng liên kết, hai phản ứng có quá trình phản ứng tích cực tạo ra phức hợp, cũng có phản ứng phân ly phức hợp tạo ra kháng nguyên, quá trình phản ứng ngược kháng thể, kết quả cuối cùng là trạng thái cùng tồn tại của kháng nguyên, kháng thể và phức hợp kháng nguyên-kháng thể.

Phản ứng này được gọi làPhản ứng đảo ngược。
Khi tốc độ của phản ứng tích cực và phản ứng nghịch đảo bằng nhau trong một phản ứng có thể đảo ngược, nồng độ kháng nguyên, nồng độ kháng thể và nồng độ phức hợp kháng nguyên-kháng thể trong hệ thống phản ứng không còn tăng hoặc giảm, phản ứng có thể đảo ngược được hoàn thành và nồng độ mol của các thành phần trong hệ thống phản ứng ở trạng thái cân bằng động.

Mối quan hệ(Sự thân thiện)Là một thông số đặc trưng của trạng thái tương đối giữa kháng nguyên, kháng thể và phức hợp kháng nguyên-kháng thể trong quá trình phản ứng đảo ngược, tên chuyên môn hơn và thuật ngữ của nó là hằng số cân bằng phân ly KD, đơn vị mol/L(phù hợp với đơn vị đo nồng độ)。

Giá trị lực tương tác càng nhỏ thì lực tương tác càng mạnh, lực tương tác mạnh yếu quyết định cuối cùng khi phản ứng hoàn thành có thể đảo ngược bao nhiêu thành phần.

Ví dụ B và C cũng giống như CD279 200nm(PD1)Phản ứng, kháng thể pembrolizumab(Kháng thể PD1)ái lực 0,4nM so với CD279, ligand CD274(PDL1)Với ái lực 8.200 nM so với CD279, phản ứng cuối cùng tạo ra phức hợp pembrolizumab-CD279 là 97,86 nM, trong khi phức hợp CD274-CD279 chỉ có 2,35 nM, chênh lệch 42 lần.

Khác với các phản ứng không thể đảo ngược, ngoài nồng độ mol của kháng nguyên, kháng nguyên và kháng thể(Phối tử và thụ thể)Mối quan hệ giữa hai sẽ * ảnh hưởng đến bao nhiêu sản phẩm được tạo ra trong phản ứng đảo ngược.

Bạn có biết các nguyên tắc cơ bản của ELISA trong việc phát triển phương pháp luận không?

Đối với tổng quan về phương pháp và nguyên lý xác định sức tương tác, bạn đọc có thể tham khảo bài đánh giá sức tương tác của công nghệ đánh giá lựa chọn công năng sinh học.
Bài viết này chủ yếu khái quát về phương pháp nồng độ bão hòa.
Rđại diệnChấp nhậnhoặcKháng nguyên，Lđại diệnPhối tửhoặcKháng thể。
Sử dụng phương pháp nồng độ bão hòa, nếu bạn muốn xác định ái lực của phối tử đối với thụ thể, sự hiện diện của một lượng nhỏ R, L được pha loãng gradient, phát hiện nồng độ của phức hợp R-L, khi nồng độ của phức hợp R-L chiếm một nửa tổng nồng độ R, giá trị nồng độ tương ứng của L(Từ EC50)Giá trị KD của L so với R.
RL Complex/R là giá trị tín hiệu có thể được phát hiện bằng giá trị B thay thế, mối quan hệ hàm giữa L pha loãng gradient và tín hiệu đáp ứng công thức sau, chỉ ở đây giá trị EC50 có thể tương đương với giá trị KD trong các điều kiện thí nghiệm cụ thể.
Có một số điểm chính để xác định giá trị KD bằng phương pháp nồng độ bão hòa,Đó là hai phân tử tương tác, R với số lượng nhỏ và L để pha loãng gradient liên tục, giá trị đáp ứng tín hiệu cần thu được(Tất cả các vị trí kết hợp của R được chiếm bởi L)Giai đoạn nền tảng, sau đó nồng độ L cần thiết khi chiếm một nửa R trong điều kiện này(Từ EC50)giá trị KD.
Phương pháp nồng độ bão hòa chủ yếu xác định giá trị tín hiệu đại diện cho phức hợp RL, có thể là tế bào dòng chảy, đánh dấu đồng vị, phân cực huỳnh quang hoặc ELISA.

IV. Phương pháp ELISA để phát triển các phương pháp phổ biến để xác định ái lực

bố cục

Quy trình vận hành chung

01Chuẩn bị tấm Enzyme: lấy nồng độ kháng nguyên 100 ug/ml, hòa tan ở nhiệt độ phòng, gói trộn được pha loãng bằng chất lỏng theo các bước sau đến 0,2 ug/ml, 0,5 ug/ml, 1 ug/ml, thêm 100ul/lỗ theo bảng bố trí mẫu, thêm vào tấm Enzyme tương ứng(Lưu ý 1)Trong đó thêm vào bao bị dịch làm bao bị kháng thể đối chiếu, 2 - 8 độ C qua đêm;
02Rửa tấm với chất lỏng rửa 3 lần, vỗ khô, thêm 300ul/lỗ đóng chất lỏng(Lưu ý 2)Đóng cửa nhiệt độ phòng trong 1 giờ; Tẩy rửa ba lần, vỗ khô chờ dùng;
03Pha loãng kháng thể với gradient 3 lần bắt đầu 100.000 ng/ml theo cách bố trí(Lưu ý 3)Theo bố cục, 100 ul/lỗ được thêm vào bảng vi lỗ;
04Đặt vàoOrhaus Micropore tấm dao động (ISLDMPHDG)Bên trong, thiết lập 37 ℃, 600 vòng/phút dao động trong 1 giờ;

05Dùng nước tẩy rửa rửa ba lần, đập khô;
06Kháng thể liên kết enzyme pha loãng đến nồng độ thích hợp(Lưu ý 4)TrongVòng xoáy Ohaus(VXMNFS)trênTrộn đều, 100 ul/lỗ;

07Đặt bên trong bộ dao động tấm micropore, đặt dao động 37 ℃, 600 vòng/phút trong 1 giờ;
08Dùng nước tẩy rửa rửa 4 lần, đập khô;
09Lấy chất lỏng màu tương ứng với kháng thể liên kết enzyme, 20 phút trước khi dùng lấy ra cân bằng đến nhiệt độ phòng, trộn đều trên máy trộn lốc xoáy;
10Sử dụng 8 khẩu súng trung đội để thêm chất lỏng kết xuất màu 100 ul/lỗ;
11Chất lỏng kết xuất màu Nhiệt độ phòng Tránh ánh sáng 10-30 phút(Lưu ý 5)；
12Kết thúc phản ứng bằng cách sử dụng 8 khẩu súng trung đội với 100 ul/lỗ(Tùy thuộc vào chất nền, bước này có thể không cần thiết)；
13Xác định giá trị tín hiệu với máy đo enzyme(Lưu ý 6)；
14Phân tích kết quả(Lưu ý 7)。

Nhỏ Note

Lưu ý 1:Nếu cần giảm nồng độ kháng thể cao trong quá trình phản ứng(100000ng / ml)Sự hấp thụ không đặc hiệu của tấm nhãn enzyme. Trong quá trình bọc, nên chọn tấm nhãn enzyme kỵ nước(Polystyrene)Nồng độ kháng nguyên của bao bì cần một lượng nhỏ 0,2 - 1 ug/ml, tình huống cụ thể cần căn cứ vào kích thước ái lực của kháng thể kháng nguyên để phán đoán tối ưu hóa. Nói chung lực tương tác càng mạnh, hàm lượng kháng nguyên cần thiết càng thấp.
Lưu ý 2:Chất lỏng kín không nhất thiết có thể tạo ra hiệu quả khép kín, cần kiểm tra thực nghiệm.(Nhóm các kháng nguyên chưa được bọc)Nói chung, chất phong bế có trọng lượng phân tử càng nhỏ thì hiệu quả càng tốt.
Lưu ý 3:Trong giai đoạn đầu của sự phát triển phương pháp có thể kéo dài phạm vi nồng độ của đường cong tiêu chuẩn 100000ng/ml-0,1ng/ml để có được đường cong đầy đủ với giai đoạn nền tảng lên xuống rõ rệt, khi ái lực giữa kháng nguyên mạnh, nồng độ gradient có thể được thu nhỏ, và bội số pha loãng có thể được thu nhỏ lại đến 2 lần trong quá trình tối ưu hóa phương pháp.
Lưu ý 4:Quá nhiều hiệu ứng kháng thể liên kết enzyme, pha loãng kháng thể liên kết enzyme cần phải làm độ pha loãng khác nhau để lựa chọn so sánh, đối với các thành phần của kháng thể liên kết enzyme, nếu độ pha loãng cao và thấp của hai kháng thể liên kết enzyme có thể tạo ra cùng một đường cong liều lượng, cho thấy quá nhiều kháng thể liên kết enzyme, truyền tín hiệu ELISA không tạo ra sai lệch.
Đối với kháng thể liên kết enzyme có thành phần đa kháng, việc đánh giá độ pha loãng của nó khá phức tạp, có thể tính toán sơ bộ rằng nồng độ mol của kháng thể liên kết enzyme cao hơn gấp 5 lần nồng độ mol của kháng nguyên trên bao bì. Khi nồng độ kháng thể liên kết enzyme nhỏ, các kháng thể liên kết enzyme bị bắt ở liều cao ở các nồng độ kháng thể khác nhau và đường cong có nền tảng giả.
Lưu ý 5:Đối với chất nền có giá trị hấp thụ và chất nền huỳnh quang, giá trị tín hiệu và thời gian kết xuất màu được phát hiện bởi thiết bị tỷ lệ thuận, điều khiển trong 10-30 phút là thích hợp. Cần phải xác nhận trước phạm vi tuyến tính tín hiệu của dụng cụ phát hiện, chẳng hạn như giá trị hấp thụ enzyme thông thường của phạm vi tuyến tính tín hiệu là 0-3, giá trị hấp thụ giữa 3-4 là phi tuyến tính, khi kết xuất màu nên kiểm soát giá trị tín hiệu không vượt quá 3, khi giá trị tín hiệu vượt quá phạm vi tuyến tính, đường cong có nền tảng giả.
Lưu ý 6:Các chất nền khác nhau cần được phát hiện bằng các dụng cụ khác nhau, giá trị đọc hấp thụ, giá trị đọc huỳnh quang, giá trị đọc phát quang hóa học. Trong quá trình lựa chọn chất nền, hãy chú ý xem liệu máy đo enzyme của phòng thí nghiệm có chức năng đọc loại này hay không.
Lưu ý 7:Đường cong liều tiêu chuẩn phù hợp thường phù hợp với bốn tham số, cần có thời gian nền tảng lên xuống rõ rệt(Giá trị A, D)Độ dốc thường là 0,8 - 1,2.(Giá trị B)Giữa, EC50（Giá trị (Đó là giá trị ái lực của kháng thể so với kháng nguyên.

V. Kết luận

Theo phương pháp nồng độ bão hòa, khi sử dụng ELISA để xác định ái lực, cần có một đường cong loại S bốn tham số rõ ràng, nghĩa là cần có một đường cong tín hiệu thay đổi dần dần với nồng độ kháng thể.
Ở nồng độ kháng thể thấp và cao có giai đoạn tăng và giảm rõ rệt, một nửa giá trị tín hiệu tăng tương ứng với nồng độ kháng thể(Từ EC50)Giá trị là giá trị KD ái lực giữa kháng nguyên kháng thể.
Bởi vì phạm vi tuyến tính của tín hiệu phát hiện của thiết bị là hữu hạn, khi tín hiệu vượt quá phạm vi tuyến tính sẽ làm cho đường cong đi vào giai đoạn nền tảng giả tạo khiến cho ái lực đo được không chính xác.
Nồng độ kháng nguyên của bao bì trực tiếp quyết định giá trị tín hiệu của tín hiệu,Vì vậy, khi sử dụng ELISA để xác định ái lực, nồng độ kháng nguyên của túi càng nhỏ càng tốt để có được giá trị tín hiệu phù hợp; Nồng độ kháng thể liên kết enzyme quá thấp cũng có thể đưa đường cong vào giai đoạn nền tảng giả.

Trong quá trình phát triển phương pháp ELISA, quá liều kháng thể liên kết enzyme để truyền tín hiệu tuyến tính cần được xác minh bằng thực nghiệm.
Khi tín hiệu không thể đạt được giai đoạn tăng trưởng hiệu quả, có nghĩa là ái lực giữa các kháng nguyên quá yếu hoặc quá nhiều kháng nguyên, cần nồng độ kháng thể lớn hơn để tất cả các kháng nguyên bị bắt để đạt được giai đoạn tăng trưởng.
Bị giới hạn bởi độ nhạy ELISA, yếu ở một số ái lực(> 100 nM)Trong kháng nguyên kháng thể, phương pháp ELISA về cơ bản không đạt được thời gian nền tảng hiệu quả và cũng không thể đo được ái lực.
Khi ELISA tiến hành đo ái lực để đánh giá hoạt động của kháng nguyên hoặc xác định hoạt động của kháng thể, EC50 thu được không phải càng nhỏ càng tốt, tín hiệu đi vào giai đoạn nền tảng giả.(Đạt đến giới hạn phát hiện của thiết bị, nồng độ liên kết enzyme nhỏ hơn)Tất cả đều làm cho EC50 nhỏ hơn, dẫn đến dữ liệu ái lực sai, đây cũng là sai lầm dễ xảy ra khi ELISA tiến hành đo ái lực.
Nhiều nhà cung cấp protein kháng nguyên ngày nay đánh giá hoạt động kháng nguyên là sai lầm.

Mối quan hệ giữa kháng nguyên và kháng thể được xác định bởi cấu trúc và tương tác của cả hai.Nó có thể là 0,1 nM, 1 nM hoặc 1000 nM. Để đánh giá hiệu quả của các phương pháp đo ái lực ELISA, cần phải xem giá trị EC50 này có phù hợp với giá trị ái lực hay không, giá trị ái lực có thể được xác minh bằng các phương pháp nhiệt động lực học, động lực học và luồng tế bào trong nồng độ bão hòa.
Ngược lại, khi một phương thức ELISA không tồn tại, chẳng hạn như tín hiệu đi vào giai đoạn nền tảng giả(Đạt đến giới hạn phát hiện của thiết bị, nồng độ liên kết enzyme nhỏ hơn)Trong trường hợp sai lầm, giá trị EC50 của nó có thể là giá trị số của ái lực phản ứng thực sự.

Phát triển phương pháp với ELISA đòi hỏi phải xác định rõ mục đích ứng dụng, định lượng phân tử lớn và xác định ái lực.
Đối với các mục đích ứng dụng khác nhau, nồng độ liều tương đối của kháng nguyên và kháng thể sẽ khác nhau rất nhiều, với đường cong liều lượng khác nhau,Độc giả có thể tiến hành nghiên cứu so sánh kết hợp với bài viết trước "ELISA Methodology Development Practice Edition - Quantitative Methodology Development for Biomolecular Detection" để làm rõ sự khác biệt.

Chia sẻ kỳ này đến đây thôi, chúng ta gặp lại kỳ sau nhé!

Bài viết trước

Ohaus hỗ trợ quá trình nội địa hóa vắc-xin HPV
Sự thật về mã hóa gen - Giải mã CRISPR
Những người muốn mua giường lắc trong phòng thí nghiệm, đang chú ý cái gì?
Thiết bị thí nghiệm của anh lại đình công à?
Phương pháp phát triển ELISA
Kẻ giết người đáng sợ hơn cả bệnh bạch cầu - bệnh sán máng
Ứng dụng của máy lắc Ohaus trong xử lý máu

Bạn muốn tìm hiểu về các sản phẩm chất lượng cao của Ohaus? Xin vui lòng liên hệ với chúng tôi, để lại thông tin của bạn, kỹ sư chuyên nghiệp của chúng tôi sẽ hết lòng phục vụ bạn!
Để đọc thêm các bài viết hay, chào mừng bạn đến vớiWeChat công cộngOhaus Hoa Kỳ！