Mùa khai giảng lại đến rồi.Thí nghiệm WangLại đi "dọn gạch"
Làm thế nàoƯuNhã chuyển gạchvẫnKhông cần giúp đỡ.Sư huynh sư tỷ

Tất nhiên rồi.theo dõiLời bài hát: Little O'ClassCộtDạ

Hôm nay, O 'Brien giới thiệu với các bạn.
Là một bài báo.Hàng khô đầycủa
Hướng dẫn thực hành phương pháp hiển thị phage
"Sự khuếch đại và định lượng của phage"

Đây là một bản ghi chép học bá hiếm có.
Xin hãy cất đi!

Phần 1

Khối u lai、Nhân bản tế bào đơnvàCông nghệ hiển thị phageĐó là ba kỹ thuật chính được phát hiện kháng thể, trong đó......Công nghệ hiển thị phagenhưCông nghệ NOWCó vai trò hết sức quan trọng trong quá trình nghiên cứu phát triển y dược sáng tạo sinh học,* Đẩy nhanh tiến trình nghiên cứu phát triển các loại thuốc kháng thể.Công nghệ hiển thị phageKhông chỉ có vai trò trung tâm trong việc phát hiện và tối ưu hóa kháng thể và polypeptide mới, mà còn kết hợp với công nghệ miễn dịch động vật truyền thống, kết nối hiệu quả với nền tảng phát hiện chuột biến đổi gen nano, toàn bộ nguồn gốc con người,Có khả năng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như kháng thể, thuốc kết nối kháng thể và CAR-T/TCR-T。Bài viết này sẽ thảo luận chi tiết thí nghiệm tăng sinh và khuếch đại thể thực khuẩn về công nghệ trưng bày thể thực khuẩn, chia sẻ kinh nghiệm của quá trình thí nghiệm cụ thể, lấy nguyên lý làm gốc để hướng dẫn quá trình thí nghiệm, lấy quá trình thí nghiệm cầu toàn, tăng tỷ lệ thành công của công nghệ trưng bày thể thực khuẩn trong quá trình phát hiện kháng thể.

Phần 2

Thư viện phage
Nguyên tắc cơ bản của việc mở rộng và hiển thị

Hệ thống mà các phage hiện đang được sử dụng phổ biến để hiển thị các mảnh kháng thể được gọi là"Hệ thống 3+3"B5-03=giá trị thông số Ki, (cài 3)；3+3Có hai nguồn protein capsid P3:

• Hạt thực khuẩn (phagemid)
• M13KO7 Thực khuẩn phụ trợ (Helper Phage)

Hạt vi khuẩnProtein p3 trên (phagemid) hợp nhất các gen của các mảnh kháng thể và là chìa khóa cho sự đa dạng của thư viện;Thể thực khuẩn phụ trợProtein p3 trên (Helper Phage) là protein p3 tự nhiên của thể thực khuẩn.
* Hạt thực khuẩn là một chất mang plasmid tương đối nhỏ, có hiệu quả chuyển đổi cao trong trạng thái thụ thể E. coli và có thể mở rộng trong E. coli.

Sau khi bị nhiễm bởi một thể thực khuẩn phụ (Helper Phage), E. coli chứa các hạt vi khuẩn sẽ sử dụng hệ thống enzyme, nguyên liệu và năng lượng của E. coli để khuếch đại, cuối cùng thể thực khuẩn chứa các hạt vi khuẩn sẽ được giải phóng khỏi E. coli, protein capsid p3 của thể thực khuẩn con này sẽ hiển thị các đoạn kháng thể.

Phần 3

Trong quá trình khuếch đại phage
Vấn đề gặp phải và giải pháp tương ứng

Quá trình xây dựng ngân hàng của phage thực sự là một quá trình phân phối sự đa dạng di truyền của các mảnh kháng thể:
Quá trình truyền từ sự đa dạng của các gen kháng thể trong mẫu máu đến các hạt thực khuẩn là nội dung của việc xây dựng thư viện hạt thực khuẩn;
Từ sự đa dạng của các hạt vi khuẩn được truyền đến sự đa dạng của E. coli có chứa các hạt vi khuẩn, là nội dung của plasmid hạt vi khuẩn điện chuyển E. coli;
Sự đa dạng truyền từ vi khuẩn E. coli chứa các hạt thực khuẩn đến sự đa dạng của thể thực khuẩn là nội dung mở rộng thể thực khuẩn và cũng là vấn đề được quan tâm trong kinh nghiệm thực nghiệm của bài viết này.

Mục đích cuối cùng của khuếch đại thể thực khuẩn là biến một bản sao duy nhất của gen mảnh kháng thể trong hạt thực khuẩn thành 10-100 bản sao thông qua quá trình khuếch đại thể thực khuẩn,Và các bản sao của gen này có thể hiển thị các đoạn protein kháng thể trên protein p3 trên bề mặt thực khuẩn.

Trong quá trình khuếch đại thể thực khuẩn muốn cho tính đa dạng của thư viện văn học được duy trì và truyền đi, cần căn cứ vào kích thước ban đầu của thư viện văn học để xác định số lượng và thể tích của vi khuẩn E. coli có chứa hạt thực khuẩn trong quá trình khuếch đại, tương ứng với bao nhiêu thể thực khuẩn phụ trợ được thêm vào để tiến hành lây nhiễm có hiệu quả, cũng như sau khi khuếch đại thêm vào bao nhiêu thể thực khuẩn có chứa hạt thực khuẩn để tiến hành đào bới các vấn đề cần tính toán đánh giá từng cái một,Thư viện thể thực khuẩn có kích thước khác nhau cần tăng thể tích trong quá trình mở rộng là không giống nhau.Một sơ đồ thử nghiệm cố định rất có thể sẽ dẫn đến mất đi tính đa dạng của thư viện.
Để biết rõ những vấn đề này, đầu tiên phải có một số kiến thức cơ bản sau:

（ 👇 Dưới đây là toàn bộ điểm nhấn!! ）

1. Đọc TG1 E. coli tại OD600: 1OD đại diện cho nồng độ vi khuẩn 1 e9 mỗi ml.
2. Thể thực khuẩn/thể thực khuẩn phụ trợ có hiệu quả lây nhiễm tương đối tốt khi TG1 ở log * và giá trị OD600 của TG1 ở log * là 0,4-0,8.
3. Tốc độ tăng trưởng của TG1 trong logarithmic* là 20 phút một thế hệ, cần theo dõi chặt chẽ sự tăng trưởng của TG1, kịp thời lấy vi khuẩn để tiến hành thí nghiệm.4. Tỷ lệ MOI của thể thực khuẩn phụ trợ và TG1 có thể đảm bảo rằng tất cả các TG1 bị nhiễm ở 20: 1.
5. Các thể thực khuẩn có chứa các hạt vi khuẩn có khả năng lây nhiễm E. coli TG1 bình thường và giữ các hạt vi khuẩn trong TG1 và mở rộng khi TG1 mở rộng, không có sự mở rộng của thể thực khuẩn mà không có sự hỗ trợ của thể thực khuẩn.
6.Plasma hạt thực khuẩn chứa kháng * và phage phụ trợ chứa kháng *.
7. Các thể thực khuẩn có chứa các hạt thực khuẩn có thể được xác định chuẩn độ bằng cách nhiễm TG1 bình thường, gradient pha loãng tấm agar kháng *.8.Trong mô hình 3+3, các thể thực khuẩn chứa các hạt thực khuẩn cho thấy hiệu quả của protein phân đoạn kháng thể tổng hợp p3 tương đối thấp, chỉ 5% -10%, khi tiến hành đào bới, độ chuẩn của thể thực khuẩn được thêm vào phải gấp hơn 100 lần tính đa dạng của thư viện.
Và một câu hỏi quan trọng hơn là......Vi khuẩn, như một loại virus, có thể dễ dàng lây nhiễm E. coli dương tính với yếu tố F bằng cách lây lan vào không khí làm ô nhiễm môi trường của phòng thí nghiệm dưới dạng bình xịt.(Đau lòng một chút sinh vật uông, mạo hiểm tánh mạng chuyển gạch a!)
ởCác thí nghiệm liên quan đến thể thực khuẩnCần thực hiện trong một phòng thí nghiệm tương đối khép kínĐể tránh ô nhiễm vi khuẩn E. coli,Đặc biệt là khi nuôi cấy E. coli TG1 bình thường. Chế độ bất hoạt của phage thường là hơn nửa giờ chiếu xạ tia cực tím.
(đủ tư cách sinh vật Uông, là cái chớ có cảm tình virus sát thủ!)

Phần 4

- Mở rộng phageTăng và định lượng
Chia sẻ quá trình thí nghiệm cụ thể

Dưới đây là sơ đồ thử nghiệm mở rộng với một thư viện phage có kích thước 1E9.
* Nếu thư viện văn bản quá lớn hoặc quá nhỏ, bạn có thể tăng hoặc giảm thể tích theo tỉ lệ.

Ngày 1
(Một ngày dọn gạch hói đầu)

1. Lấy vi khuẩn TG1 có chứa hạt vi khuẩn 1ml (số lượng vi khuẩn 1E10) và thêm vào bình lắc có chứa 100ml 2xYT-GA 250ml,Sử dụngMáy lắc Ohaus37 độ 220rpm Shaker Shaker đến OD600 là khoảng 0,5。2. Lấy 20 ml dung dịch vi khuẩn có OD600 khoảng 0,5 (số lượng vi khuẩn 1E10), thêm phage phụ M13 K07 với pfu 2E11 theo MOI 20: 1, dao động 37 độ 220rpm trong nửa giờ để lây nhiễm.3. Lấy chất lỏng vi khuẩn sau khi nhiễm trùng để sử dụng ống ly tâm 50mlMáy ly tâm Ohaus 5816R3200g ly tâm 10 phútLoại bỏ môi trường nuôi cấy để loại bỏ glucose trong môi trường nuôi cấy ức chế sự biểu hiện protein p3 trong các hạt thực khuẩn kết hợp các đoạn protein kháng thể.4. Khối treo lại với môi trường 2xYT-AK, cộng môi trường lên đến 400ml và qua đêm với bình lắc 1L ở 30 độ 220rpm.

Ngày 2
(Ngày thứ hai sau khi dọn gạch)

5.Chia đều 400 ml dịch nấm vào bình ly tâm lớn,Sử dụngMáy ly tâm Ohaus 5816R 10000g ly tâm 10 phútLấy thanh lọc, 10.000 g ly tâm lần nữa trong 10 phút,Loại bỏ các mảnh nấm còn sót lại.6. Lấy 90ml dung dịch PEG và thêm 400ml dung dịch làm sạch, ủ ở 4 ℃ trong 1 giờ với dao động nhẹ, sau đóSử dụng chức năng điều khiển nhiệt độ thấpMáy ly tâm Ohaus 5816R 4 ℃ 10000g ly tâm 1 giờ。7. Sau khi khử trùng, treo lại phage với 10ml PBS, thêm 2,5ml dung dịch PEG để kết tủa một lần nữa.8. ủ trên băng trong 20 phút và sau đóSử dụng chức năng điều khiển nhiệt độ thấpMáy ly tâm Ohaus 5816R4 ℃ 10000g ly tâm nửa giờ。9. Loại bỏ chất lỏng, hút khô dung dịch PEG còn lại bằng giấy thấm nước, thêm 1-2ml PBS Heavy Suspension để xác định độ chuẩn.

Đo chuẩn độ:
1. Trong phòng thí nghiệm tách biệt, lấy vi khuẩn E. coli TG1 bình thường và thêm vào môi trường 2xYT,Sử dụngMáy lắc OhausGiá trị dao động đến OD600 là 0,5Nếu không sử dụng kịp thời, bạn có thể cho vào 4 độ C 2 tiếng để dự phòng.
2.Pha loãng 1E5-1E7 lần với PBS để khuếch đại phage protease ở bước 9.
3. Lấy dung dịch pha loãng phage 10ul và thêm vào vi khuẩn TG1 E. coli 490ul OD600 0,5,Sử dụngMáy lắc Ohaus 37 ℃ 220rpm Dao động trong nửa giờTiến hành nhiễm trùng.
4. Lấy chất lỏng nhiễm trùng 50ul và áp dụng đều vào tấm thạch có chứa 2xYT-GA, sau khi sấy khô cho vào tủ nuôi cấy 37 ℃ qua đêm. Và sử dụng tấm agar không bị nhiễm TG1 E. coli làm đối chứng âm tính.

Ngày 3
Ngày thứ ba dọn gạch hói đầu

5. Nhân bản trong tấm agar với số lượng 2xYT-GA, tính toán độ chuẩn của phage khuếch đại theo bội số pha loãng
Tiêu chuẩn phage (pfu/ml)=(Clone * 10 * 50/10ul) * Pha loãng bội số
6.Các phage lấy 1E11-1E12 để chọn lọc.

Công thức thuốc thử:
Môi trường 2xYT:Chiết xuất men 10,0 g / L + Tryptone 16,0 g / L + NaCl 5,0 g / L
Môi trường 2xYT-GA:Môi trường 2xYT+100 μg/ml *+1% (W/V) glucose
Môi trường 2xYT-AK:Môi trường 2xYT+100μg/ml *+50μg/ml *
PEG溶液：20% (w / v) PEG 6000, 2,5 M NaCl

Phần 5
Công cụ *:

(Mỗi ngày làm nghiên cứu khoa học dân công đều không cô đơn, bởi vì có Tiểu Áo làm bạn)

Thể thực khuẩn, như một loại virus, có thể dễ dàng lây lan trong không khí dưới dạng bình xịt vào môi trường phòng thí nghiệm gây ô nhiễm, đòi hỏi một phòng thí nghiệm khép kín, nơi tất cả các dụng cụ của phòng thí nghiệm cần được sử dụng một mình.
Trang chủNhiệt độ không đổi tải nhẹ nuôi cấy rockerPhạm vi tốc độ quay là 100-12-rpm, tích hợp khối lượng và mạnh mẽ để cung cấp hiệu ứng lắc tuyệt vời cho mẫu của bạn:

Ngoài ra, sẽ có các khối lượng khác nhau, tốc độ quay khác nhau và các bước ly tâm đòi hỏi điều kiện 4 ℃ trong quá trình trình hiển thị phage, nếuVớinhiều
Máy ly tâmĐáp ứng nhu cầu thử nghiệmSẽ tạo thành tài sản thiết bị thí nghiệm trống rỗng, tạo thành lãng phí!！！

Trang chủMáy ly tâm đa chức năng 5816RVà cánh quạt tùy chọn tạo điều kiện cho các thí nghiệm liên quan đến phage, một máy ly tâm đáp ứng tất cả các nhu cầu thí nghiệm!

Tiếp theo, O 'Brien sẽ đưa anh đi.
Tiết kiệm chi phí nghiên cứu khoa học cho xe
Dạy con cách nhổ lông cừu của O 'House.

Đức*
Chức năng mạnh mẽ và hiệu ứng ly tâm tuyệt vời
Khách sạn Frontier Frontier ™ Gia đình máy ly tâm
Giới thiệu"Mua một tặng một"* Sự kiện

* Mô hình như dưới đây
Máy ly tâm tốc độ caoSản phẩm FC5515R(Mô hình đông lạnh)
Máy ly tâm tốc độ caoFC5515(Mô hình không đông lạnh)
Máy ly tâm Micro Compact mớiHệ thống FC5513
Bây giờ lên xe, còn kịp mà!

Để biết thêm chi tiết, xin vui lòng quét mã vạch 2 chiều. 👇

Muốn biết thêm vềSản phẩm phòng thí nghiệm OhausThông tin? Mời vào"Đọc toàn văn"Để lại tin nhắn, kỹ sư chuyên nghiệp của chúng tôi sẽ cấp tốc chạy tới, phục vụ ngài!
▼